核心关键词：DSPE-PEG-MAL，巯基 - 马来酰亚胺偶联，四嗪 - TCO IEDDA 点击化学，mRNA-LNP，胶束后插入修饰，EGFR 靶向，西妥昔单抗

Preparation of Targeted Lipid Nanoparticles by Insertion of Either Tetrazine–trans-Cyclooctene or Thiol–Maleimide Micelles Online

February 18, 2026

https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.5c00608

一、研究背景

1.mRNA-LNP 临床应用局限 脂质纳米粒（LNPs）是成熟的非病毒核酸递送载体，但商用 LNPs 天然仅富集肝脏，难以实现肝外实体瘤靶向；需在 LNP 表面共价修饰靶向配体（单克隆抗体、靶向多肽），特异性识别肿瘤细胞膜表面 EGFR 受体，拓展实体瘤靶向 mRNA 免疫治疗应用场景。

2.现有靶向修饰两大技术痛点 主流修饰工艺分为直接混合偶联、胶束预成型后插入两种：直接混合法易破坏 LNP 磷脂双层结构，大幅降低 mRNA 包封率；行业缺少巯基 - 马来酰亚胺、四嗪 - TCO 两类正交点击化学对 LNP 储存稳定性、细胞转染效率、抗体配体偶联活性的系统性平行对照数据，无标准化靶向 LNP 制备工艺参考。

3.两种核心活化 PEG 磷脂对比空白 DSPE-PEG-MAL（巯基特异性偶联）是市面成熟商业化靶向磷脂，依靠巯基 - 马来酰亚胺 Michael 加成实现抗体偶联；新型 DSPE-PEG-TCO 依托逆电子需求狄尔斯 - 阿尔德（IEDDA）无铜正交点击反应，不受生物内源性巯基干扰，但二者修饰 mRNA-LNP 的工艺适配性、体内外肿瘤靶向递送性能缺少完整对照研究。

4.研究目的 以临床获批 EGFR 靶向西妥昔单抗为模型靶向配体，横向对比 DSPE-PEG-MAL 巯基偶联、DSPE-PEG-TCO 四嗪点击化学两套修饰体系；同步验证直接混合、预成胶束插入两种 LNP 表面修饰工艺，筛选可低温长期稳定储存、高 mRNA 包封率、高 EGFR 肿瘤细胞转染效率的靶向 LNP 标准化制备方案。

二、标准化实验体系设计

1.基础 mRNA-LNP 固定处方 固定商用经典核酸递送配方：DLin-MC3-DMA（可电离脂质）+ DSPC + 胆固醇 + DMG-PEG₂₀₀₀；采用乙醇稀释法制备空白 LNP，包载 GFP 报告基因 mRNA，原始 mRNA 包封率稳定维持 80% 以上。

2.两条靶向磷脂修饰实验组 1）巯基 - 马来酰亚胺体系（DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL） 西妥昔单抗经 N - 琥珀酰亚胺 S - 乙酰硫代乙酸酯活化修饰，在抗体赖氨酸残基上引入游离巯基；中性水环境下巯基与 DSPE-PEG-MAL 末端马来酰亚胺发生 Michael 加成反应，制备西妥昔单抗 - PEG 磷脂偶联物。 2）四嗪 - TCO 正交点击体系（DSPE-PEG₂₀₀₀-TCO） 西妥昔单抗修饰 2,5 - 二氧代吡咯烷基 - 4-(1,2,4,5 - 四嗪 - 3 - 基) 苯甲酸酯，在抗体表面引入四嗪活性基团；四嗪与 DSPE-PEG-TCO 末端反式环辛烯（TCO）发生 IEDDA 无铜点击反应，完成抗体与活化磷脂共价偶联。

3.两种 LNP 表面修饰工艺对比 ① 直接混合法：抗体 - PEG 磷脂偶联物水溶液直接与预制 mRNA-LNP 室温混合孵育； ② 胶束预成型插入法：先将靶向磷脂与 DMG-PEG₂₀₀₀共组装形成混合胶束，60 ℃条件下混合胶束与成熟 LNP 共孵育，磷脂疏水尾部嵌入 LNP 脂质双层完成表面靶向修饰。

3.核心检测指标 mRNA 包封率、纳米粒粒径 / Zeta 电位、4 ℃低温长期储存稳定性、EGFR 高表达肿瘤细胞摄取效率、GFP mRNA 体外蛋白表达水平、细胞荧光定量强度。

三、核心实验结论（DSPE-PEG-MAL 重点）

1.胶束预成型插入工艺是唯一可稳定规模化制备靶向 LNP 的方案 直接混合法会破坏 LNP 磷脂膜结构，造成 mRNA 大量泄露、包封率骤降；采用 DSPE-PEG-MAL 预成混合胶束后插入修饰得到的靶向 LNP，可在 4 ℃稳定储存 3 周，纳米粒粒径、Zeta 电位无明显波动，mRNA 包封率持续维持 80% 以上，储存稳定性显著优于直接混合组。

2.DSPE-PEG-MAL 与 DSPE-PEG-TCO 两套体系体外靶向转染效率相当 两种点击化学修饰的靶向 LNP 作用于 EGFR 阳性肿瘤细胞时，孵育 6 h 后 GFP 阳性细胞比例均可达 97%；空白未靶向 LNP 对照组阳性细胞比例不足 30%；两套体系处理后细胞平均荧光强度均提升 3 倍以上，肿瘤靶向富集效果无统计学显著差异。

3.DSPE-PEG-MAL 商业化应用优势更突出，工艺门槛更低 DSPE-PEG-MAL 为市面成熟量产试剂，采购价格低廉、反应条件温和，弱中性水环境即可完成抗体偶联；而 DSPE-PEG-TCO 属于实验室定制新型磷脂，合成工艺复杂、原料成本高昂，仅适用于多配体正交标记基础科研场景，不适合工业化制剂开发。

4.靶向修饰不会改变 LNP 基础理化特性 经 DSPE-PEG-MAL 胶束插入修饰后的靶向 LNPs 依旧保持近中性 Zeta 电位，纳米粒粒径无明显增大；表面 PEG 亲水链完整保留长循环隐形特性，进入血液后不会引发大量血清蛋白吸附，体内循环稳定性不受影响。

四、四大核心创新点

1.首次平行对比巯基 - 马来酰亚胺、四嗪 - TCO 两套 PEG 磷脂点击化学修饰 mRNA-LNP 填补 DSPE-PEG-MAL 与新型 TCO 活化磷脂在核酸递送载体领域的横向对照研究空白，为靶向 LNP 工业化试剂选型提供完整、可重复的实验数据依据。

2.明确 “胶束预成型后插入” 为 mRNA-LNP 靶向修饰最优标准化工艺 解决直接混合偶联破坏核酸包封稳定性的行业共性难题，建立一套可工业化复刻、批次稳定的靶向 LNPs 完整制备流程。

3.以临床获批西妥昔单抗为模型抗体，成果可直接向肿瘤靶向 mRNA 药物转化 区别于小分子多肽配体，单抗修饰 LNP 更适配实体瘤精准靶向免疫 mRNA 治疗，研究方案贴近临床制剂开发需求，转化潜力更高。

4.建立靶向 LNP 长期储存稳定性定量评价体系 首次定量验证 DSPE-PEG-MAL 修饰 LNPs 在 4 ℃储存 3 周过程中的理化稳定性与转染活性保留能力，弥补靶向核酸制剂储存工艺开发的数据空白。

五、科研与产业转化应用价值

1.基础科研价值 完整阐明 DSPE-PEG-MAL 马来酰亚胺偶联修饰 mRNA-LNP 全流程反应机理，系统对比两套正交点击化学的适配场景；为 EGFR、HER2 等各类单抗靶向核酸纳米载体开发提供通用标准化实验范式。

2.mRNA 制剂处方开发 针对肝外实体瘤靶向 mRNA 药物研发，优先推荐 DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL 搭配胶束后插入修饰工艺，兼顾原料易得性、低温储存稳定性与肿瘤靶向转染效率，大幅降低靶向 LNP 研发与生产成本。

3.临床转化指导 现有商用 mRNA 疫苗 LNPs 仅依靠被动肝脏富集，本文提供模块化表面靶向改造成熟方案，无需重新优化可电离脂质核心处方，可快速改造已上市核酸纳米载体实现实体瘤特异性递送。

4.跨体系拓展适配 该胶束插入修饰工艺可迁移至 DSPE-PEG-NHS、DSPE-PEG-FA、DSPE-PEG-ICG 等全部功能化 PEG 磷脂，适配脂质体、聚合物胶束、细胞膜仿生纳米载体等各类纳米递送系统。

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