核心关键词：DSPE-PEG-MAL，巯基 - 马来酰亚胺偶联，点击化学，mRNA-LNP，后插入修饰，EGFR 靶向，四嗪 - TCO

Preparation of Targeted Lipid Nanoparticles by Insertion of Either Tetrazine–trans-Cyclooctene or Thiol–Maleimide Micelles

Published January 30, 2026

DOI：10.1021/acs.bioconjchem.5c00608

 一、研究背景��

1. mRNA-LNP 临床应用局限 脂质纳米粒（LNPs）是成熟的非病毒核酸递送载体，但商用 LNPs 天然仅富集肝脏，难以实现肝外实体瘤靶向；需在 LNP 表面共价修饰靶向配体（抗体、多肽），特异性识别肿瘤细胞膜表面受体，拓展肿瘤靶向 mRNA 治疗场景。

2. 现有靶向修饰两大技术痛点 主流修饰工艺分直接偶联与胶束后插入：直接偶联易破坏 LNP 原有胶体稳定性、降低 mRNA 包封率；而不同点击化学（巯基 - 马来酰亚胺、四嗪 - TCO）对 LNP 储存稳定性、细胞转染效率、配体偶联活性的系统性对比数据缺失，无标准化工艺参考。

3. 两种核心活化 PEG 磷脂对比空白 DSPE-PEG-MAL（巯基特异性偶联）是最常用商业化靶向磷脂；新型 DSPE-PEG-TCO 无生物内源性巯基干扰，可实现无催化剂正交点击反应，但二者修饰 mRNA-LNP 的工艺适配性、体内外递送性能缺少平行对照研究。

4. 研究目的 以 EGFR 靶向西妥昔单抗为模型配体，横向对比 DSPE-PEG-MAL 巯基偶联、DSPE-PEG-TCO 四嗪点击化学两套修饰体系；同步验证直接混合、预成胶束插入两种工艺，筛选可稳定储存、高 mRNA 包封率、高肿瘤细胞转染效率的靶向 LNP 标准化制备方案。

二、标准化实验体系设计

1. 基础 mRNA-LNP 固定处方

固定商用经典配方：DLin-MC3-DMA+DMG-PEG₂₀₀₀+ 胆固醇 + DSPC，包载 GFP 报告基因 mRNA；乙醇稀释法制备原始空白 LNP，mRNA 包封率稳定 80% 以上。

2. 两条靶向磷脂修饰实验组

1）巯基 - 马来酰亚胺体系（DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL） 西妥昔单抗经 N - 琥珀酰亚胺 S - 乙酰硫代乙酸酯修饰，引入游离巯基；再与 DSPE-PEG-MAL 发生 Michael 加成反应，制备抗体 - 靶向磷脂偶联物。 2）四嗪 - TCO 正交点击体系（DSPE-PEG₂₀₀₀-TCO） 西妥昔单抗修饰 2,5 - 二氧代吡咯烷基 - 4-(1,2,4,5 - 四嗪 - 3 - 基) 苯甲酸酯，引入四嗪基团；与 DSPE-PEG-TCO 发生逆电子需求狄尔斯 - 阿尔德（IEDDA）无铜点击反应。

3. 两种 LNP 表面修饰工艺对比

① 直接混合法：抗体 - PEG 磷脂偶联物溶液直接与预制 mRNA-LNP 混合孵育； ② 胶束预成型插入法：先将靶向磷脂与 DMG-PEG 共组装为混合胶束，再与成熟 LNP 60 ℃共孵育完成膜嵌入。

4. 核心检测指标

mRNA 包封率、纳米粒粒径 / Zeta 电位、4 ℃长期储存稳定性、EGFR 阳性细胞摄取效率、GFP mRNA 体外蛋白表达水平、细胞荧光定量。

三、核心实验结论（DSPE-PEG-MAL 重点）

1. 胶束预插入工艺是唯一可稳定规模化制备靶向 LNP 的方案

直接混合法会破坏 LNP 磷脂双层结构，大幅降低 mRNA 包封率；而DSPE-PEG-MAL 预成混合胶束后插入得到的靶向 LNP 可在 4 ℃稳定储存 3 周，粒径、电位无明显变化，mRNA 包封率维持 80% 以上，储存稳定性显著优于直接混合组。

2. DSPE-PEG-MAL 与 DSPE-PEG-TCO 两套体系体外靶向转染效率相当

两种点击化学修饰的靶向 LNP 在 EGFR 高表达细胞中，GFP 阳性细胞比例均达 97%；空白未靶向 LNP 对照组仅不足 30%；两种体系细胞平均荧光强度均提升 3 倍以上，靶向富集效果无显著差异。

3. DSPE-PEG-MAL 商业化优势更突出，工艺门槛更低

DSPE-PEG-MAL 是成熟量产试剂，价格低廉、反应条件温和（弱中性水环境即可完成偶联）；而 DSPE-PEG-TCO 属于新型定制磷脂，合成成本高、原料普及度低，更适合复杂多配体正交标记基础研究。

4. 靶向修饰不会改变 LNP 基础理化特性

经 DSPE-PEG-MAL 胶束插入修饰后的靶向 LNPs 仍保持近中性 Zeta 电位，无明显粒径增大，保留原始长循环隐形特性，不会引发血清蛋白大量吸附。

四、四大核心创新点��

1. 首次平行对比巯基 - 马来酰亚胺、四嗪 - TCO 两套 PEG 磷脂点击化学修饰 mRNA-LNP 填补 DSPE-PEG-MAL 与新型 TCO 活化磷脂在核酸递送载体领域的横向对照研究空白，为靶向 LNP 试剂选型提供直接实验依据。

2. 明确 “胶束预成型后插入” 为 mRNA-LNP 靶向修饰最优标准化工艺 解决直接偶联破坏核酸包封稳定性的行业共性难题，给出可工业化复刻的靶向 LNPs 制备流程。

3. 以临床获批西妥昔单抗为模型抗体，成果可直接向肿瘤靶向 mRNA 药物转化 区别于多肽小分子配体，单抗修饰 LNP 更适配实体瘤精准靶向免疫 mRNA 治疗，贴近临床制剂开发需求。

4. 建立靶向 LNP 长期储存稳定性评价体系 首次定量验证 DSPE-PEG-MAL 修饰 LNPs 低温储存 3 周的理化与转染活性保留能力，解决制剂储存工艺开发数据缺失问题。

五、科研与产业转化应用价值

1. 基础科研价值 完整阐明 DSPE-PEG-MAL 马来酰亚胺偶联修饰 mRNA-LNP 全流程反应机理，对比正交点击化学适配场景，为 EGFR、HER2 等各类单抗靶向核酸载体开发通用实验范式。

2. mRNA 制剂处方开发 针对肝外实体瘤靶向 mRNA 制剂，优先推荐 DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL 搭配胶束后插入工艺，兼顾原料易得性、储存稳定性与靶向转染效率，大幅降低靶向 LNP 研发成本。

3. 临床转化指导 现有商用 mRNA 疫苗 LNPs 仅依靠被动肝富集，本文提供模块化表面靶向改造成熟方案，无需重新优化可电离脂质核心处方，可快速改造已上市核酸纳米载体实现肿瘤特异性递送。

4. 跨体系拓展适配 该胶束插入修饰工艺可迁移至 DSPE-PEG-NHS、DSPE-PEG-FA、DSPE-PEG-ICG 等所有功能化 PEG 磷脂，适配脂质体、胶束、细胞膜仿生载体等各类纳米递送系统。