一、研究背景

药物诱导肝损伤（DILI）由氧化应激失衡、线粒体稳态破坏共同驱动，KEAP1蛋白是该过程的关键负调控靶点：KEAP1一方面介导NRF2泛素化降解，抑制细胞抗氧化防御；另一方面结合PGAM5，破坏线粒体结构，加剧肝细胞氧化损伤、线粒体裂变与凋亡。现有干预手段存在以下缺陷：

1.传统NRF2激活剂仅能解离KEAP1-NRF2的相互作用，无法同步调控PGAM5线粒体通路，线粒体修复能力有限；

2.小分子抑制剂无肝脏靶向富集特性，全身分布会引发毒副作用，且肝组织药物暴露量不足；

3.缺乏可同时激活抗氧化、线粒体稳态双重通路的KEAP1靶向降解分子。

本研究从天然产物库中筛选得到可结合KEAP1的先导分子小豆蔻明（CAD），经衍生设计合成PROTAC降解剂8L，实现了肝脏选择性富集，可靶向降解肝细胞KEAP1，同步激活NRF2抗氧化程序与PGAM5线粒体保护通路，协同改善氧化应激、修复线粒体稳态，缓解对乙酰氨基酚、顺铂诱导的药物性肝损伤。

二、KEAP1靶向PROTAC分子8L筛选与合成路线

1. 天然产物库高通量筛选先导化合物CAD

收集含查尔酮、黄酮类化合物的天然小分子库，结合KEAP1热位移实验（TSA）、NRF2荧光素酶报告基因实验两套筛选体系，经交叉验证确定小豆蔻明Cardamonin（CAD）具备最优的KEAP1结合亲和力与NRF2激活活性。

2. CAD衍生PROTAC分子的修饰优化

对CAD进行丁酰化修饰得到CAD-1，以CAD骨架为配体连接泛素化招募链，设计得到系列PROTAC嵌合分子；经细胞水平筛选得到活性最优分子8L，可高效介导肝细胞内KEAP1蛋白的泛素化降解。

3. 分子作用模式验证

8L一端结合KEAP1蛋白，另一端招募E3泛素连接酶，形成三元复合物诱导KEAP1发生泛素标记，随后经蛋白酶体降解；分子动力学模拟证实，8L与KEAP1的结合口袋匹配度优异。

三、KEAP1降解介导双重通路协同肝保护的分子机制

1. 释放NRF2激活全局抗氧化防御

KEAP1降解后，NRF2入核结合ARE元件，上调HO-1、NQO1、SOD等抗氧化蛋白；同时协同PGC-1α、TFAM促进线粒体生物发生，提升mtDNA拷贝数，清除胞内过量ROS，缓解氧化应激损伤。

2.释放PGAM5修复线粒体动态平衡

KEAP1与PGAM5的结合被破坏，引发PGAM5蛋白蓄积上调，进而：

A.上调MFN2、OPA1，抑制线粒体过度裂变，促进线粒体融合；

B.激活PINK1/Parkin通路介导线粒体自噬，清除受损线粒体；

C.稳定线粒体膜结构，阻断线粒体凋亡通路，维持线粒体完整稳态。

3.双重通路协同对抗DILI

抗氧化通路清除氧化应激源头，线粒体修复通路恢复肝细胞能量代谢，二者协同阻断“药物毒性-氧化应激-线粒体损伤-肝细胞坏死”级联反应，显著降低肝组织炎症与细胞凋亡水平。

4.肝脏靶向富集优势

体内药代动力学实验证实，8L给药后优先富集于肝脏组织，在外周脏器分布低，治疗窗口宽、生物安全性良好。

四、研究核心点

1.天然产物导向的KEAP1 PROTAC全新骨架：以天然查尔酮CAD为结合配体，区别于传统杂环配体，为KEAP1靶向药物提供了天然来源的低毒降解分子骨架；

2.KEAP1降解介导双重通路协同保护的新机制：首次证实靶向降解KEAP1可同步激活NRF2抗氧化、PGAM5线粒体稳态两条独立肝保护通路，实现双重协同效应；

3.具备肝脏选择性富集特性的降解剂：PROTAC分子拥有天然肝靶向分布特性，可提升病灶药物浓度、降低全身毒副作用；

4.双筛选体系建立了标准化KEAP1配体筛选范式：联合热位移+荧光素酶双模型，可高效精准筛选KEAP1结合先导分子，为KEAP1靶向药物开发提供了通用筛选方案。

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