关键词：赤霉素A₄，酿酒酵母，甲羟戊酸途径，细胞色素 P450 酶系，萜类化合物

Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for De Novo Biosynthesis of Gibberellin A4

 J. Agric. Food Chem. 2026, 74, 17, 13737–13746

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c13533

一、研究背景与目的

赤霉素A₄（Gibberellin A₄, GA₄）是一种具有重要农业应用价值的生物活性二萜类植物激素，但传统丝状真菌发酵工艺存在效率低、副产物复杂、成本高等局限性。本研究旨在通过代谢工程改造酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），构建高效的GA₄从头生物合成平台，为其绿色可持续生产提供新方案。

二、核心研究策略与技术路线

1. 前体供应强化：甲羟戊酸（MVA）途径优化

通过过表达ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20等关键酶增强MVA途径通量，同时引入异源酶（如黄柄牛肝菌Xanthopaxillus dubius来源的GGPP合酶XdGGPPS），提升关键中间体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的供给水平，为GA₄生物合成提供充足前体。

2. 代谢流动态调控：平衡生长与产物合成

利用麦角固醇响应型启动子P_ERG1，结合动态下调ERG9基因表达，阻断GGPP流向角鲨烯/麦角固醇的竞争支路，实现细胞生长与产物合成的动态平衡，显著提升中间产物贝壳杉烯酸（ent-kaurenoic acid, KA）的积累量。

3. 异源合成途径构建：GA₄生物合成模块组装

A. KA合成模块：引入藤仓赤霉Gibberella fujikuroi的CPS/KS酶和甜菊Stevia rebaudiana的KO酶，实现从GGPP到KA的转化；

B. GA₄合成模块：对比植物、真菌和细菌来源的细胞色素P450酶系，筛选出真菌来源的P450系统（如P450-1、P450-2、KAO/CYP114、GA20ox/CYP112、GA3ox/CYP115），构建高效的GA₄合成途径；

C. 多拷贝整合与内质网工程：通过多拷贝染色体整合提高途径基因表达量，同时过表达内质网合成相关基因（INO2/ICE2）并敲除PAH1，缓解P450酶的膜定位饱和瓶颈，提升酶催化效率。

三、关键结果与性能表现

1. 菌株构建与优化：通过模块化组装和多轮代谢工程改造，获得了高效生产GA₄的酿酒酵母工程菌株；

2. 摇瓶发酵性能：筛选得到的真菌来源P450途径工程菌株（SG27）在摇瓶中GA₄产量可达3.3 mg/L；

3. 5 L生物反应器放大：在优化的补料发酵工艺（含氮源补充）条件下，工程菌株GA₄产量提升至48.6 mg/L，达到目前酿酒酵母中GA₄合成的较高水平；

4. 产物验证：通过质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）对产物进行表征，证实合成产物为目标GA₄。

四、研究创新与优势

1. 动态代谢调控策略：首次将ERG9动态下调与麦角固醇响应型启动子结合，有效平衡了细胞生长与萜类合成通量；

2. 真菌P450途径优势：证实真菌来源的P450酶系在GA₄合成中具有比植物/细菌途径更高的催化效率；

3. 内质网工程应用：通过内质网改造缓解了P450酶的膜定位瓶颈，为真核生物中复杂萜类的合成提供了通用策略；

4. 模块化设计平台：整合模块化途径组装、动态调控与细胞器工程，构建了可推广的二萜类化合物生物合成平台。

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