核心关键词：COOH-PEG-COOH，双羧基 PEG 交联剂，聚烯丙胺纳米凝胶，透明质酸纳米凝胶，Ni²⁺/Co³⁺金属配位，His 标签罗丹明，蛋白定向固定，抗肿瘤药物递送

Metal-Coordinated His-Tag Functionalization of Polymeric Nanogels for Therapeutic Applications Online

March 27, 2026

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsanm.5c05531

一、研究背景

1.聚合物纳米凝胶生物递送核心优势与改性痛点 纳米凝胶（NGs）是高分子纳米递送载体，具备载药容量高、胶体稳定性优异、生物相容性好等优势，是靶向生物医学治疗、抗肿瘤药物递送的核心候选材料。但传统共价偶联方式对纳米凝胶表面进行生物分子修饰时，容易破坏蛋白、多肽、抗体等敏感生物配体的空间结构与生物活性，无法实现定向、可逆的生物分子固定。

2.His 标签金属配位技术应用局限 His 标签依靠与过渡金属离子（Ni²⁺、Co³⁺等）配位实现可逆定向结合，广泛应用于实验室蛋白纯化领域，但该策略极少被应用于聚合物纳米凝胶的表面修饰改性，缺少标准化的纳米载体金属螯合配体接枝工艺。

3.氨基纳米凝胶羧基化修饰原料空白 聚烯丙胺（PAH）、氨基化透明质酸（HA）构建的纳米凝胶表面富含伯氨基，缺少可螯合金属离子的羧基活性位点；单端修饰 PEG 仅能实现纳米粒隐形水化改性，无法预留可接枝 NTA 螯合基团的羧基位点，本研究选用对称双功能 COOH-PEG-COOH作为桥接交联剂，一步完成纳米凝胶隐形修饰 + 羧基功能位点引入，解决该行业技术空白。

4.研究核心目的 以乳液蒸发法制备氨基聚烯丙胺纳米凝胶（PEG NG）、氨基透明质酸纳米凝胶（HA NG）两大载体；通过 COOH-PEG-COOH 介导表面羧基化，再接枝赖氨酸偶联氮川三乙酸（NTA），分别螯合 Ni²⁺、Co³⁺两种过渡金属离子，构建可结合 His 标签生物分子的纳米凝胶平台；横向对比 Ni²⁺、Co³⁺配位体系的 His 标签结合密度、细胞摄取效率、生物相容性，同时验证钴配位纳米凝胶作为顺铂抗肿瘤药物递送载体的治疗效果，筛选最优金属配位纳米凝胶改性体系。

二、标准化实验体系设计

1.两种氨基纳米凝胶基底制备 采用乳液 - 蒸发工艺分别制备： ① PEG NG：聚烯丙胺（PAH）基底氨基纳米凝胶； ② HA NG：氨基修饰透明质酸基底纳米凝胶； 两类纳米凝胶表面均大量暴露伯氨基，为 COOH-PEG-COOH 共价接枝提供反应位点。

2.COOH-PEG-COOH 桥接羧基化改性核心工艺 选用 4 kDa、8 kDa 双羧基封端 PEG（COOH-PEG-COOH）作为同双功能交联桥接试剂： ① EDC/NHS 缓冲液活化 PEG 两端羧基，转化为活性 NHS 酯； ② 活化后的 COOH-PEG-COOH 与氨基纳米凝胶避光搅拌反应，PEG 单端 NHS 酯与纳米凝胶表面氨基发生酰胺化共价偶联； ③ 透析去除游离未反应 PEG 与小分子活化试剂，最终纳米凝胶外层 PEG 链末端裸露游离羧基，完成羧基化改性； ④ 纳米凝胶表面游离羧基再次 EDC 活化，共价偶联氨基化赖氨酸 - NTA 金属螯合配体。

3.双金属离子螯合分组对照实验 将 NTA 修饰后的两类纳米凝胶分为两大金属离子实验组： 实验组 1：NTA 配体螯合 Ni²⁺离子； 实验组 2：NTA 配体螯合 Co³⁺离子； 完成金属螯合后，体系可通过金属配位键可逆、定向结合 His 标签修饰生物分子，本研究选用 His 标记罗丹明荧光分子作为模式探针模拟 His 标签抗原、重组蛋白。

4.两大维度性能检测指标

（1）材料理化与结合性能

纳米凝胶流体力学粒径、胶体储存稳定性、NTA 螯合配体接枝密度、His 标签罗丹明分子结合容量；

（2）细胞与抗肿瘤治疗性能

肿瘤细胞对纳米凝胶的摄取效率（NG 阳性细胞比例）、细胞生物相容性、顺铂药物负载能力、游离顺铂与钴配位载药纳米凝胶的体外肿瘤细胞杀伤效果对比。

三、核心实验结论（COOH-PEG-COOH 改性 + 金属配位体系重点）

1.COOH-PEG-COOH 是氨基纳米凝胶羧基化改性最优双功能桥接试剂 对称双羧基 PEG 仅消耗一端羧基与纳米凝胶氨基偶联，另一端稳定裸露游离羧基，可同步实现纳米凝胶表面 PEG 水化隐形修饰、金属螯合配体接枝位点引入双重功能；改性后纳米凝胶胶体稳定性大幅提升，4℃缓冲液存放 28 天无团聚，血清蛋白非特异性吸附显著降低。

2.Co³⁺金属配位体系 His 标签结合性能全面优于传统 Ni²⁺体系 同等 NTA 配体修饰条件下，Co³⁺螯合纳米凝胶的 His 标签罗丹明结合密度显著高于 Ni²⁺组；钴离子配位体系不会破坏纳米凝胶支架的生物相容性，无额外细胞毒性，适配生物体内递送场景。

3.透明质酸基底 HA NG 细胞摄取效率远高于聚烯丙胺 PEG NG 从柱状定量图可见：HA 纳米凝胶（HA NG）无论是 Ni²⁺组还是 Co³⁺组，肿瘤细胞阳性摄取比例均超过 85%；而 PEG NG 两组细胞摄取比例仅 10%~35%；透明质酸载体可利用肿瘤细胞表面 HA 受体介导胞吞，显著提升纳米凝胶细胞内化效率。

4.Co³⁺配位纳米凝胶可作为高效顺铂抗肿瘤递送载体 将钴离子螯合改性后的纳米凝胶负载顺铂化疗药物，体外卵巢癌细胞模型中，钴配位载药纳米凝胶的肿瘤杀伤治疗效果显著优于游离顺铂药物，降低化疗药物脱靶毒性，提升肿瘤局部药物富集。

5.His 标签金属配位修饰为可逆非共价改性方案，适配全系列 His 标记生物分子 相较于传统不可逆共价偶联，Ni²⁺/Co³⁺配位结合可逆可控，不会损伤蛋白、抗原、多肽生物活性；生物体内广泛存在各类 His 标签修饰生物分子，该改性策略可灵活拓展至各类 His 基元生物配体，搭建高选择性靶向纳米凝胶递送平台。

四、四大核心创新点��

1.首次将同双功能 COOH-PEG-COOH 交联剂应用于氨基纳米凝胶表面羧基化改性 建立标准化氨基高分子纳米凝胶（PAH / 透明质酸）羧基修饰工艺，一步实现纳米载体长循环隐形水化与功能羧基位点引入，填补双羧基 PEG 在纳米凝胶金属螯合改性领域的应用空白。

2.系统横向对比 Ni²⁺、Co³⁺两种过渡金属离子配位体系，证实 Co³⁺为更优 His 标签结合金属 打破行业仅使用 Ni²⁺进行 His 标签结合的固有思路，完整验证 Co³⁺配位体系在结合容量、生物相容性层面的双重优势，为金属配位纳米载体改性提供全新方案。

3.对比两种主流氨基纳米凝胶基底（PEG NG / HA NG），明确透明质酸纳米凝胶更适配肿瘤靶向递送 HA 纳米凝胶依靠受体介导胞吞实现高效肿瘤细胞摄取，为肿瘤靶向药物、抗原递送载体选型提供直接实验依据。

4.拓展金属配位 His 标签纳米凝胶至临床抗肿瘤化疗药物递送领域 验证钴配位改性纳米凝胶负载顺铂的抗肿瘤优势，将实验室蛋白纯化配位技术转化为可落地的肿瘤靶向纳米药物载体技术，具备极高临床转化潜力。

五、科研与产业转化应用价值

1.基础科研价值 完整阐明 COOH-PEG-COOH 双羧基 PEG 交联剂对氨基高分子纳米凝胶的改性反应机理；建立金属配位 His 标签定向修饰纳米载体通用范式，可适配聚烯丙胺、透明质酸、氨基 PLGA、氨基壳聚糖等全系列氨基纳米递送材料。

2.靶向纳米疫苗研发 可将 Co³⁺配位纳米凝胶与 His 标记肿瘤抗原定向结合，构建高特异性肿瘤纳米疫苗，利用 HA 纳米凝胶高效细胞摄取能力提升树突状细胞抗原呈递效率。

3.抗肿瘤化疗纳米药物开发 钴配位透明质酸纳米凝胶可作为顺铂、阿霉素等化疗药物的递送载体，降低游离化疗药物全身毒副作用，提升肿瘤局部药物富集与治疗效果。

4.生物传感与蛋白分离平台 Ni²⁺/Co³⁺改性纳米凝胶可作为固相基底，用于 His 标签重组蛋白体外捕获、分离纯化，适配 SPR 生物传感器、微流控肿瘤标志物检测芯片开发。

六、规范储存与实验操作提示（COOH-PEG-COOH 配套）

1. COOH-PEG-COOH 干粉真空密封 - 20℃避光冷冻储存，取用快速密封防潮，粉末吸潮会大幅降低羧基活化偶联效率；

2. EDC/NHS 活化羧基缓冲液 pH 维持 5.0~6.0，活化时间控制 30~60 min，活化后 NHS 中间体极易水解，1 h 内完成与氨基纳米凝胶偶联；

3. 金属 NTA 螯合反应全程中性生理缓冲液，避免强酸强碱环境破坏配位键；

4. 本体系所有纳米凝胶仅适用于体外细胞、小动物体内科研实验，不可直接作为人体临床注射成品原料。