关键词：聚氧杂环丁烷（POZ/PEOZ）、聚乙基氧杂环丁烷、单功能化聚氧杂环丁烷、POZ-NHS、聚合物-蛋白偶联

Polyoxazoline: Chemistry, Properties, and Applications in Drug Delivery

Bioconjugate Chem. 2011, 22, 5, 976–986

https://doi.org/10.1021/bc200049d

                图1 化学结构

一、研究背景

本文介绍了一类称为聚氧杂环丁烷（POZ）的聚合物。这类聚合物可制备成高质量产品，具有不同的结构和功能基团；它们不仅具备聚乙二醇（PEG）的核心优势特性，更在多种药物递送应用中展现出新颖独特的性能：呈非离子型、稳定性高且在水及有机溶剂中均具有优异溶解性。聚甲基氧杂环丁烷（PMOZ）、聚乙基氧杂环丁烷（PEOZ）和聚丙基氧杂环丁烷（PPOZ）的通用化学结构如图1所示。

研究表明，POZ可应用于多种制药和医疗领域。它可与蛋白质及小分子药物结合使用，可接枝到脂质双层膜上，可制成胶束，并可应用于表面处理。在所有这些应用中，POZ均具备与PEG相同的“隐蔽性”特性，且在动物模型中未观察到任何不良反应。

二、制备方法

聚氧杂环丁烷聚合物采用活性阳离子聚合方法制备。文献中已报道了多种制备工艺：一种方法是在干燥有机溶剂和惰性气氛下，将亲电引发剂（如烷基对甲苯磺酸酯或烷基三氟甲磺酸酯）按化学计量比加到溶解于其中的氧杂环丁烷单体上；扩散阶段在80ºC下进行约1至3天。第二种方法利用微波能量促进聚合反应，可将扩散时间从数天缩短至数小时。在这两种方法中，均通过引入亲核试剂（如OH^-、NH^-、COO^-或S^-）来终止活性阳离子链；终止方式包括使用碳酸钠水溶液生成羟基末端基团，或与吗啉或哌啶等仲胺反应形成叔胺末端基团。POZ可在引发步骤时在链的一端实现单功能化，也可在终止步骤中利用羧酸根离子实现单功能化。此外，POZ还可合成带有侧链醛基或氨基的功能基团，并以惰性基团作为末端基团。这些化学修饰方案可显著提高药物载量，这是聚乙二醇（PEG）等线性聚合物所无法实现的。

    图2 用于聚合和功能化POZ-OH及POZ-COOH的合成方案

三、POZ-NHS与胰岛素的结合反应

将胰岛素（250 mg，分子量5807 Da）悬浮于5.6 mL硼酸（50 mM）中，通过加入1 N盐酸缓慢酸化直至获得澄清溶液。随后加入1 N氢氧化钠溶液将溶液pH调节至10.5。向该溶液中缓慢加入6.9 mL PEOZ -NHS 10K在盐酸溶液中的溶液（pH 2.5，浓度70 mg/mL，含量4.1×10^5 mol）。再加入0.5 N氢氧化钠溶液将pH调至10.5。澄清溶液在室温下温和混合5.7分钟后，加入1 N盐酸将其酸化至pH 2.4。该反应通过使用C-18柱的反相 HPLC 进行监测。色谱图显示产物中含48.5%单结合型 PEOZ -胰岛素、10.6%双结合型PEOZ胰岛素及其余为天然胰岛素。通过离子交换色谱（IEC，Sepharose SP柱）主要分离出赖氨酸（B29）结合型单结合型PEOZ胰岛素，并通过缓冲液置换将洗脱液脱盐至去离子水。最终产物经SDS-PAGE和反相色谱分析纯度，并通过MALDI-TOF测定分子量。

四、POZ-NHS与BSA的偶联反应

将BSA（90 mg，分子量1.344 μmol ，含60个可参与反应的氨基）溶解于pH 8.5的0.1 M硼酸钠缓冲液中，并加入5摩尔过量的活化聚合物： PEOZ -NHS 5 kDa、PEG-NHS 5 kDa、 PEOZ -NHS 10 kDa或PEG-NHS 10 kDa。混合物搅拌数秒至均质后，在室温下静置5小时。通过加入5摩尔过量甘氨酸终止反应。使用配备30 kDa分子量截留膜（Amicon XM-30）的超滤装置去除未反应的聚合物，随后采用阳离子交换层析法分离偶联物与蛋白质及聚合物。使用SP-Sephadex C-25柱（3×18 cm）经20 mM磷酸盐缓冲液（pH 3.9）平衡，并以1 mL/min流速进行0至0.5 M氯化钠梯度洗脱。收集含偶联蛋白的组分，经浓缩并超滤脱盐后冻干获得粉末样品。各样品中的蛋白质含量通过BCA法测定，蛋白质修饰程度则采用三硝基苯磺酸反应法评估。

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