关键词：正异戊烯硫醚，烯丙基甲基碳酸酯，多肽/球状蛋白，半胱氨酸游离巯基，荧光蛋白标记，蛋白异戊二烯化修饰

Labeling and Natural Post-Translational Modification of Peptides and Proteins via Chemoselective Pd-Catalyzed Prenylation of Cysteine

J. Am. Chem. Soc. 14931–14937

https://doi.org/10.1021/jacs.9b08279 

一、研究背景

蛋白异戊二烯化是细胞内关键的天然翻译后修饰，通过硫醚键连接异戊烯基，调控蛋白膜定位、蛋白相互作用与细胞信号通路；但现有生物偶联技术存在显著局限：

1.多数多肽/蛋白修饰手段生成非天然化学键，无法复刻体内天然正异戊烯硫醚结构，难以精准模拟内源蛋白修饰的功能；

2.大量过渡金属催化的生物偶联体系易发生催化剂中毒，且官能团兼容性差，难以在水相温和条件下实现完整蛋白修饰；

3.缺少通用型底物平台，难以同时实现天然修饰复刻、荧光/亲和探针标记、多肽环化（stapling）等多种应用；

4.位点选择性难以保障，易与赖氨酸、酪氨酸等残基发生副反应。

本文构建了Pd/BIPHEPHOS催化的水相Tsuji–Trost烯丙基化体系，实现对半胱氨酸（Cys）的完全化学选择性修饰；该反应高区域选择性生成天然n-异戊烯硫醚键，可精准复刻体内异戊二烯化翻译后修饰；同时可搭载荧光标签、亲和基团等生物探针，双官能团烯丙基碳酸酯试剂还可实现双半胱氨酸多肽环化与stapling，成功搭建了多功能蛋白生物共轭平台。

二、钯催化半胱氨酸异戊二烯基化完整反应体系

1.烯丙基碳酸酯修饰试剂合成

以烯丙醇为原料，在氯甲酸甲酯、吡啶作用下制备烯丙基甲基碳酸酯骨架；可进一步衍生得到多种功能化试剂：天然异戊烯同源试剂、叠氮/炔生物正交手柄、荧光探针、亲和标签、双官能团交联试剂。所得试剂稳定性优异，合成简便，可模块化接入各类功能基团。

2.Pd/BIPHEPHOS催化体系构筑

零价钯前体搭配BIPHEPHOS双膦配体，在水相缓冲体系中原位生成活性催化物种；配体可有效避免硫醇引起的催化剂失活，解决了传统钯催化体系易中毒的难题。

3.多肽与蛋白位点选择性偶联反应

含半胱氨酸的多肽/蛋白质与烯丙基碳酸酯底物在温和水相条件下发生Tsuji–Trost烯丙基化反应；巯基专一进攻烯丙基中间体，高区域选择性生成直链型天然硫醚键，不产生支链副产物。

4.拓展应用反应

A.单官能试剂：向蛋白定点引入异戊烯基、荧光基团、亲和捕获标签；

B.双官能烯丙基碳酸酯试剂：对双半胱氨酸多肽进行分子内环化、stapling，构建构象锁定多肽。

三、催化反应与生物共轭分子机制

1.Tsuji–Trost烯丙基化催化循环

Pd (0)对烯丙基碳酸酯发生氧化加成，脱除碳酸甲酯负离子生成π-烯丙基钯中间体；多肽半胱氨酸的游离巯基作为亲核试剂进攻烯丙基端位碳，高区域选择性生成直链硫醚，经还原消除再生Pd (0)。BIPHEPHOS配体可调控钯中心的电子效应与空间位阻，保障催化活性并抑制催化剂硫中毒。

2.半胱氨酸专一化学选择性机制

在多肽的复杂官能团环境中，仅游离巯基发生亲核进攻；氨基、羟基、羧基、咪唑、酚羟基等常见氨基酸侧链均不参与反应，可实现完美的位点专一修饰。

3.天然硫醚键构建优势

反应生成与体内蛋白异戊二烯化完全一致的n-异戊烯硫醚键，不同于酰胺、三唑等人工连接键，可用于精准研究修饰蛋白的原生生理功能。

4.多功能模块化底物拓展机制

烯丙基碳酸酯骨架可便捷接入不同功能模块，一套催化体系可同时满足翻译后修饰模拟、生物成像标记、亲和富集、多肽stapling的多重需求。

四、研究核心创新点

1.首例水相兼容Pd催化构建天然n-异戊烯硫醚键，精准复刻体内蛋白异戊二烯化翻译后修饰，突破了传统生物偶联只能生成非天然连接键的局限；

2.BIPHEPHOS配体解决了钯催化剂硫中毒难题，温和水相缓冲条件可兼容多肽与完整蛋白质，官能团耐受性优异；

3.兼具高化学选择性与高区域选择性，专一修饰半胱氨酸，优先生成直链硫醚产物，无明显支链异构体；4.一体化多功能生物共轭平台：一套催化体系可同时实现天然翻译后修饰（PTM）模拟、荧光/亲和探针标记与多肽环化 stapling，底物采用模块化设计，拓展性强。

五、应用拓展与研究展望

1.催化体系优化：开发水溶性配体，进一步降低催化剂用量，适配活细胞内的原位蛋白修饰；

2.底物拓展：构建可光控、可降解的烯丙基修饰试剂，实现可逆蛋白标记；

3.生物应用延伸：制备异戊二烯化修饰重组蛋白，用于Ras等信号蛋白膜定位、细胞通路机制研究；

4.多肽药物开发：利用stapling策略稳定α螺旋多肽，提升多肽药物的抗酶解稳定性与细胞穿透能力。

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