LIFU/MMP-2 dual-responsive release of repurposed drug disulfiram from nanodroplets for inhibiting vasculogenic mimicry and lung metastasis in triple-negative breast cancer

Published: 25 April 2024

DOI：10.1186/s12951-024-02492-7

一、研究背景

1. 三阴性乳腺癌（TNBC）临床治疗核心难题

三阴性乳腺癌缺少特异性靶向受体，肿瘤内部缺氧微环境会诱导肿瘤细胞构建血管拟态（VM），该结构不依赖内皮细胞，由肿瘤细胞自主形成微循环管道，显著提升肿瘤侵袭活性与肺部远端转移概率。 现有血管拟态抑制剂存在两大致命短板：其一，普通药物载体无法穿透肿瘤致密细胞外基质 ECM，药物仅停留肿瘤表层，病灶内部药物富集量极低；其二，无响应型载体全身均匀释放药物，正常组织药物暴露量大，毒副作用明显，药物整体利用率低下，难以有效阻断血管拟态生成与肿瘤肺转移。

2. PLGA-COOH 羧基聚合物载体核心优势

本研究选用羧基封端 PLGA（PLGA-COOH）作为纳米液滴骨架材料，和 PCL-PEG-COOH 羧基活化两亲聚合物作用机制完全一致：

1. 分子末端游离羧基可通过酰胺化反应，与氨基修饰 MMP-2 酶敏感多肽 EGPLGVRGK-PEG 稳定共价结合；

2. PLGA 疏水内核可同时包裹疏水老药双硫仑 DSF、超声响应介质全氟戊烷 PFP；

3. 外层 PEG 亲水链赋予纳米粒体内长循环隐形效果，减少肝脏、脾脏网状内皮系统清除，提升肿瘤富集效率，是构建肿瘤微环境智能响应递送载体的核心原料。

3. LIFU/MMP-2 双重响应体系设计思路

1. MMP-2 蛋白酶响应脱 PEG 外壳：三阴性乳腺癌病灶高表达活化 MMP-2 蛋白酶，可特异性切割多肽 EGPLGVRGK 序列，剥离纳米粒外层亲水 PEG 屏障，暴露疏水内核，大幅提升肿瘤细胞吞噬效率，同时实现致密肿瘤基质深层穿透；

2. 低频聚焦超声 LIFU 物理响应定点释药：体外无创 LIFU 局部照射肿瘤区域，触发内核全氟戊烷 PFP 发生声学液滴汽化 ADV，撑破 PLGA 载体骨架，仅在肿瘤病灶定点释放负载药物 DSF，正常组织无药物泄漏，从根源降低全身给药毒副作用。

4. 研究目的

以羧基活化 PLGA-COOH 两亲聚合物为基础，构建 LIFU/MMP-2 双响应多功能纳米液滴 PFP@PDM-PEG；验证该纳米递送体系在 4T1 三阴性乳腺癌模型中肿瘤深层渗透、超声定点可控释放双硫仑 DSF 的能力；完整阐明载体抑制 COL1 胶原沉积、阻断 pro-MMP-2 活化、削弱血管拟态 VM 生成、阻断 TNBC 肺部远端转移的完整分子通路，为三阴性乳腺癌抗转移精准靶向治疗提供全新智能纳米平台。

二、基于 PLGA-COOH 的双响应纳米液滴完整制备工艺

1. PLGA-COOH 与酶敏感多肽酰胺化偶联（核心羧基活化反应）

原料为末端羧基功能化 PLGA-COOH、氨基修饰 MMP-2 敏感多肽 EGPLGVRGK-PEG；采用 EDC/NHS 活化体系，激活 PLGA 末端游离羧基转化为活性 NHS 酯；中性缓冲液避光条件下发生酰胺化偶联反应，依靠稳定酰胺键得到多肽修饰两亲聚合物 PLGA-EGPLGVRGK-PEG；最后透析除去未反应多肽与小分子活化试剂，真空干燥纯化备用，全程反应条件温和，可完整保留靶向多肽生物活性。

2. 多功能纳米液滴乳化成型制备

配置油相：将纯化后的 PLGA-EGPLGVRGK-PEG、疏水药物双硫仑 DSF、超声响应介质全氟戊烷 PFP 共同溶解于二氯甲烷有机溶液； 乳化成型：油相快速滴入去离子水水相，高速超声乳化制备均匀水包油纳米液滴； 纯化处理：常温搅拌挥发除去有机溶剂，经离心、透析双重纯化，得到球形规整、粒径均一、表面携带 MMP-2 酶敏感多肽的 PFP@PDM-PEG 纳米液滴。

3. 荷瘤小鼠体内给药流程

纯化后的纳米液滴分散于生理缓冲液，经小鼠尾静脉注射进入血液循环，依靠 EPR 效应富集至 4T1 肿瘤病灶；对肿瘤部位进行体外无创 LIFU 低频聚焦超声局部照射，实现肿瘤病灶定点、可控、精准药物释放。

三、双响应纳米载体完整作用通路（对应图示分步机制）

1. MMP-2 酶响应脱 PEG，实现肿瘤组织深层穿透

TNBC 肿瘤微环境大量分泌活化 MMP-2 蛋白酶，一方面降解细胞外基质 COL1 胶原，破坏 ECM 屏障，为肿瘤侵袭、血管拟态形成创造条件；另一方面特异性切割纳米粒表面 EGPLGVRGK 多肽序列，剥离外层亲水 PEG 外壳，暴露疏水内核；大幅提升 4T1 肿瘤细胞吞噬摄取效率，同时突破肿瘤致密基质屏障，实现纳米粒向肿瘤内部缺氧核心区域深层渗透，解决传统纳米载体仅滞留肿瘤表层的缺陷。

2. LIFU 低频超声触发声学汽化，肿瘤定点释放双硫仑 DSF

对肿瘤区域施加无创 LIFU 超声照射后，纳米液滴内部包裹的全氟戊烷 PFP 发生声学液滴汽化 ADV，液滴快速膨胀破裂，破坏 PLGA 聚合物载体骨架；包裹的疏水药物双硫仑 DSF 仅在肿瘤病灶定点大量释放，远离超声照射的正常组织无药物泄漏，彻底规避全身化疗带来的脏器毒副作用；同时 PFP 汽化产生的超声造影信号可实现肿瘤病灶可视化成像，完成诊疗一体化。

3. DSF 多通路抑制血管拟态 VM，阻断三阴性乳腺癌肺转移

肿瘤局部释放的双硫仑 DSF 通过三层通路抑制血管拟态与肿瘤转移：

1. 抑制 COL1 胶原表达：下调肿瘤细胞 COL1 蛋白合成，减少细胞外基质胶原沉积，破坏血管拟态管道形成的结构基础；

2. 限制 pro-MMP-2 活化：阻断无活性前体蛋白酶 pro-MMP-2 向活化 MMP-2 转化，减少 ECM 基质降解，抑制肿瘤细胞侵袭、迁移活性；

3. 最终阻断血管拟态生成：胶原沉积抑制与 MMP-2 活性阻断双重作用下，肿瘤细胞无法自主构建血管拟态微循环通道，切断肿瘤细胞体内循环转移通路，显著降低原发三阴性乳腺癌向肺部远端转移的概率。

四、关键体外 & 体内实验结果

1. 纳米液滴理化性能与双响应特性表征

纳米液滴呈规整球形，粒径区间 150–180 nm，PDI＜0.15，水分散性优异、储存稳定性强； MMP-2 酶响应验证：仅在含活化 MMP-2 蛋白酶的肿瘤微环境模拟缓冲液中发生 PEG 外壳剥离，正常生理无酶环境下载体结构稳定，无提前脱壳风险； LIFU 超声释药特性：无超声照射条件下 72 h 药物泄漏率低于 12%，局部 LIFU 照射后 2 h 累计药物释放量达 76%，释药精准可控； 超声成像功能：PFP 汽化产生 ADV 超声造影信号，可同步完成肿瘤病灶可视化诊断与靶向药物治疗。

2. 体外细胞层面实验结果

肿瘤细胞摄取实验：MMP-2 酶预处理完成脱 PEG 外壳后的纳米液滴，4T1 三阴性乳腺癌细胞摄取量是完整 PEG 包覆纳米粒的 3.9 倍； 血管拟态管腔形成实验：游离双硫仑单药仅微弱抑制 VM 管状结构生成，PFP@PDM-PEG 纳米液滴联合 LIFU 超声处理组抑制效率超 90%，几乎完全阻断血管拟态管道形成； 肿瘤基质侵袭实验：联合处理组 4T1 肿瘤细胞穿透胶原基质的迁移、侵袭活性被显著抑制。

3. 4T1 荷瘤小鼠体内动物实验结果

肿瘤深层渗透效果：静脉注射纳米液滴后，LIFU 超声处理组纳米粒可有效渗透至肿瘤缺氧核心区域，无酶敏感多肽的普通对照纳米粒仅滞留于肿瘤表层； 原发肿瘤生长抑制：PFP@PDM-PEG 联合 LIFU 治疗组原发肿瘤体积生长抑制率达 87.2%，疗效远优于游离双硫仑单药组（肿瘤抑制率仅 36.5%）； 肺部远端转移阻断效果：生理盐水空白对照组小鼠 100% 出现肺部多发肿瘤转移结节；双响应纳米液滴联合 LIFU 处理组仅 8% 小鼠出现微小肺部转移结节，绝大多数小鼠完全无肺转移； 体内生物安全性：全程给药周期内小鼠体重无明显下降，心、肝、脾、肾主要脏器病理切片无损伤病变，PLGA 载体与双硫仑药物全身毒性极低。

五、文章核心创新点

1. 羧基聚合物修饰体系创新：依托 PLGA-COOH 末端活性羧基，通过温和酰胺化反应共价偶联 MMP-2 酶敏感靶向多肽，成功构建肿瘤微环境响应型智能纳米递送载体；修饰工艺稳定、多肽接枝率高、生物相容性优异，验证了羧基化两亲聚合物在肿瘤智能靶向递送领域的核心应用价值。

2. 双机制协同响应载体设计：创新性融合MMP-2 蛋白酶响应肿瘤深层穿透与LIFU 无创超声定点可控释药双重响应机制，解决传统纳米载体肿瘤穿透能力差、药物全身泄漏、靶向特异性弱的行业痛点。

3. 老药新用低成本靶向治疗策略：将临床安全、价格低廉的成熟老药双硫仑 DSF 负载于智能双响应纳米液滴，低成本、高安全性实现三阴性乳腺癌血管拟态抑制与抗远端转移治疗，具备极高临床转化潜力。

4. 肿瘤诊疗一体化多功能纳米平台：纳米液滴同时兼具肿瘤超声造影可视化成像、肿瘤病灶精准靶向给药、抑制血管拟态抗转移治疗三重功能，构建 “成像诊断 - 靶向给药 - 抗肿瘤转移治疗” 一体化纳米诊疗平台，为恶性肿瘤精准诊疗提供全新思路。

5. 完整抗转移分子作用通路阐明：系统完整梳理纳米载体从体内循环富集、肿瘤基质深层渗透、超声定点药物释放，到抑制 COL1 胶原沉积、阻断 MMP-2 活化、削弱血管拟态生成、阻断肺部远端肿瘤转移的全链条分子机制，为三阴性乳腺癌靶向制剂研发提供完善理论支撑。

六、拓展应用场景

1. 三阴性乳腺癌原发瘤靶向化疗、术后抗复发干预、预防肺部远端肿瘤转移；

2. 胰腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等高血管拟态表型恶性肿瘤的酶敏感超声响应智能靶向递送制剂开发；

3. 超声影像可视化引导下的实体肿瘤精准靶向药物治疗；

4. PLGA-COOH/PCL-PEG-COOH 羧基活化两亲聚合物通用智能响应载体平台，适配各类老药新用、靶向多肽修饰、超声 / 光响应多功能纳米递送体系构建。